ヒスチジンは長時間持続します

Scientific Reports volume 5、記事番号: 15356 (2015) この記事を引用

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グリア瘢痕の形成は、脳虚血後の神経新生および神経機能の回復を妨げます。ヒスタミンは脳虚血後の初期段階で神経保護作用を示しましたが、特にグリア瘢痕形成に対するその長期的な影響は特徴づけられていません。ヒスタミンの前駆体であるヒスチジンについて構築されたさまざまな投与計画により、初期段階では高用量、後期では低用量のヒスチジン治療が、梗塞体積の減少と神経機能の改善を伴う最も顕著な長期神経保護効果を実証したことがわかりました。注目すべきことに、この治療計画はグリア瘢痕領域も確実に縮小し、梗塞中心への星状細胞の移動を促進しました。創傷治癒アッセイおよびトランスウェル試験では、ヒスタミンは星状膠細胞の遊走を有意に促進しました。 H2 受容体アンタゴニストは、星状細胞遊走の促進とヒスチジンによってもたらされる神経保護を逆転させました。さらに、ヒスタミンはGTP結合低分子GTPアーゼRac1を上方制御する一方、Rac1阻害剤NSC23766はヒスチジンの神経保護とアストロサイト遊走の促進を無効にした。我々のデータは、H2受容体を介した用量/病期依存性のヒスチジン治療が梗塞中心への星状膠細胞の遊走を促進し、これが脳虚血後の長期的な神経学的回復に利益をもたらすことを示した。したがって、ヒスタミン作動系を標的とすることは、アストロサイトへの作用を通じた長期脳虚血傷害に対する効果的な治療戦略となる可能性がある。

脳虚血は成人の死亡および障害の主な原因です。現在、脳虚血の唯一承認されている治療法は組換え組織プラスミノーゲン活性化因子であり、虚血後 4.5 時間以内に投与すると虚血領域に再灌流をもたらします。虚血後の長期にわたる脳損傷に対して有効な治療用神経保護剤はまだ存在しない。脳虚血後の複雑な病態生理学的事象は時間的および空間的に進行し1、これが実行可能な神経保護剤の開発を妨げます2。例えば、NMDA アンタゴニストは虚血後の初期段階で神経興奮毒性を軽減するのに効果的ですが、NMDA 受容体は神経可塑性において重要であるため、長期的な神経学的回復には有利ではない可能性があります 3,4。

アストロサイトは、脳虚血後のニューロンの病態生理学的進行に決定的に関与しています。脳虚血の発症から早ければ6時間後には、アストロサイトが活性化して、おそらく抗酸化防御、代謝サポート、神経保護物質の分泌を介してニューロンの生存を促進します。これらの反応性星状細胞は、病変の広がりと局所免疫応答を制限する障壁も形成します5、6。したがって、アストロサイトの生存を改善することは、脳虚血から脳を保護するための重要な手段です7。しかし、グリア瘢痕は、主にアストロサイトで構成される障壁であり、虚血性神経損傷の後期段階で神経新生を妨げる可能性があります。実際、グリア瘢痕の抑制は神経新生と神経学的回復に利益をもたらす可能性があります8。このことは、アストロサイトの時間依存性の影響を調整することにより、用量と段階に応じた治療戦略が虚血性脳損傷の合理的な治療法となる可能性を高めています。

我々の以前の研究では、ヒスタミンがアストロサイトを酸素-グルコース欠乏による損傷から有意に保護することが判明しました9。アストロサイトの H1 受容体を介したグルタミン合成酵素およびグルタミン酸トランスポーター 1 発現のアップレギュレーションは、余分な細胞外グルタミン酸のクリアランスを介してヒスタミンの保護効果に寄与し、脳虚血の初期段階での興奮毒性の軽減に役立ちます 9,10。さらに、ヒスタミンが脳虚血後の初期段階で神経保護を提供することを示す多くの証拠がある 11,12。ヒスタミンの前駆体であるヒスチジンを再灌流直後および再灌流の 6 時間後に腹腔内投与すると、一過性中大脳動脈閉塞 (tMCAO) によって誘発される梗塞が著しく軽減されます 11。ヒスタミンは、H2 受容体および cAMP/PKA 経路を介して NMDA 誘発興奮毒性を緩和することにより、直接的な神経保護効果があると考えられています 13。また、中枢ヒスタミン作動性活性の増強により、脳虚血後の炎症細胞の動員が抑制されます14。総合すると、ヒスタミン作動系は脳虚血誘発性脳損傷の潜在的な治療標的であると考えられます。

しかし、脳虚血後のヒスタミンの長期的な影響、特にグリア瘢痕形成に関する後期段階の星状膠細胞に対するその影響は調査されていない。ヒスタミンは血液脳関門を直接通過できないため、ヒスチジンを使用して、脳虚血に対する行動的および組織学的反応に対するヒスタミンの長期的な影響と、さまざまな段階に関連した投与計画の下での潜在的なメカニズムをテストしました。

脳虚血後の病態生理学的事象は複雑であり、急性興奮毒性と炎症性浸潤は通常虚血発症後 1 週間以内に起こりますが、グリア瘢痕形成と神経新生はその後に現れることが多い 1。したがって、最初に、脳虚血の研究でよく選択される用量であるヒスチジンの用量（200、500、または1000 mg/kg）を最初の1週間で実験しました11、15、16。神経学的欠損スコア（図1A; n = 13〜15）およびMRIによる梗塞領域の測定（補足図1; n = 5〜6）によって証明されるように、最高用量が最も顕著な保護を提供することがわかりました。したがって、最初の週の用量として 1000 mg/kg が選択され、後の週には異なる他の用量が投与されました。さまざまな治療計画（早期投与量と後期投与量の組み合わせとして示されている）の下で、モリス水迷路と恐怖条件付けテストを使用して、線条体などの記憶関連の脳領域に対するヒスチジンの神経学的パフォーマンスと認知能力に対する長期的な影響を評価しました。大脳新皮質と扁桃体は、tMCAO 後に損傷を受けることがよくあります 17、18、19、20。ヒスチジン治療 (1000 ～ 500 mg/kg) が神経学的パフォーマンスに対して最も顕著な保護効果を示したことがわかりました (図 1B; 14 日目と 28 日目では n = 13 ～ 15; 42 日目と 28 日目では n = 7 ～ 9) 56日目）。虚血後 22 日または 50 日後に実施されたモリス水迷路試験では、すべてのヒスチジン処理により空間学習プロセスにおける逃避潜時が大幅に短縮されました（一般線形モデルで分析、P < 0.05、図 1D: n = 13 ～ 15、図 1D: n = 13 ～ 15、図 1D: n = 13 ～ 15 . 1F：n=7～9）。しかし、記憶保持を指すプローブトライアルでは、両者に違いはありません。恐怖条件付けテストでは、ヒスチジン (His) 1000 ～ 500 群は、他の治療組み合わせと比較して、27 日および 55 日で最高の文脈記憶および手がかり記憶を示しました (図 1E: n = 13 ～ 15、図 1G: n = 7-9)。

ヒスチジンは、局所脳虚血後の神経機能と認知能力に神経保護を提供します。

神経学的スコアは、ヒスタミン（A、200、500、または1000 mg/kg）治療下で虚血後1日、3日、7日に評価され、虚血後14日、28日、42日、56日後に評価されました。ヒスチジン治療（B、最初の週は 1000 mg/kg、その後の週は 0、200、500、または 1000 mg/kg、His 1000–0、His 1000–200、His 1000–500 または His 1000 と命名） -1000)。認知能力は、虚血後のモリス水迷路（D：22〜24日目、F：50〜52日目）および文脈および手掛かり恐怖条件付けテスト（E：27日目、G：55日目）によって検査されました。 (D) の 24 日目の代表的な遊泳経路を (C) に示し、灰色の円はプラットフォームの位置を示します。 A、B (14 日目および 28 日目)、D および E では n = 13 ～ 15。 B (42 日目および 56 日目)、F および G では n = 7 ～ 9。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、各試験日または各試験内の偽グループとの比較、 #各試験日または各試験内での tMCAO グループとの比較、P < 0.05、##P < 0.01、###P < 0.001。

次に、さまざまなヒスチジン治療計画に従って組織学的評価を実施しました。 tMCAO の 28 日後および 56 日後にトルイジンブルー (TB) 染色を使用することにより、His 1000-200 および 1000-500 の組み合わせのみが梗塞領域を著しく減少させることがわかりました (図 2A、C: n = 10-12、図 2A、C: n = 10-12; . 2E: n = 6–7)。梗塞コア周囲のグリア瘢痕領域は、GFAP ジアミノベンジジン組織化学染色から定量化されました。 His 1000-500 による治療のみ、虚血後 28 日および 56 日でグリア瘢痕領域が大幅に減少しました (図 2B、D: n = 10-12、図 2F: n = 6-7)。 tMCAO 群と他のヒスチジン治療群の間では、グリア瘢痕領域の統計的に有意な変化は検出されませんでした。総合すると、これらのデータは、ヒスチジンが脳虚血後に長期の神経保護を提供し、His 1000-500 治療が神経機能とグリア瘢痕形成の減少に対して最も強力な保護を示したことを示しています。

ヒスチジンは、局所脳虚血後の梗塞領域とグリア瘢痕領域を縮小します。

ヒスチジン治療の異なるレジメンの下で、tMCAO 後 28 日 (C) および 56 日 (E) に TB 染色で梗塞領域を推定し、代表的な層を (A) に示します。グリア瘢痕領域も、tMCAO 後 28 日 (D) および 56 日 (F) に GFAP 染色で推定し、代表的な写真を (B) に示します (B1 は定量化された領域を示し、B2 ～ B5 は拡大したグリア瘢痕エッジを示します) ）。 C と D の場合は n = 10–12。 E および F では n = 6 ～ 7。B1: バー = 500 μm。 B2–5: バー = 100 μm。 *P < 0.05、***P < 0.001、tMCAO グループと比較。

グリア瘢痕形成は通常、GFAP アップレギュレーションによる活性化、増殖、病変端への移動などの星状細胞の形態的および機能的変化によって生じます 21,22。したがって、ヒスチジンによるグリア瘢痕領域の縮小はおそらくこれらに関連している可能性があります。側面。この仮説を検証するために、半影領域における星状細胞の活性化を免疫組織化学およびウェスタンブロットによって調べた。脳虚血後、アストロサイトは GFAP の発現増加により著しく活性化されましたが、虚血後 7 日目には His 1000 の治療はアストロサイトの活性化にそれ以上の影響を与えず、虚血後 14 日目の His 1000-0 および 1000-500 の治療も同様でした。虚血（補足図2; n = 6〜7）。続いて、半影領域の BrdU+/GFAP+ 細胞の定量に基づいて星状細胞の増殖を評価しました。 His 1000-500 処理後に BrdU+ 細胞の数は増加しましたが、BrdU+/GFAP+ 細胞数は変化しませんでした (補足図 3; n = 6-7)。これは、ヒスチジンが星状細胞の増殖に影響を及ぼさないことを示しています。培養星状細胞における創傷治癒アッセイにより、星状細胞の活性化、増殖、遊走に対するヒスタミンの直接作用を分析することができます。ヒスタミン処理後、GFAP発現とBrdU+細胞の数は創傷境界で変化しませんでした（補足図4）。したがって、アストロサイトの活性化と増殖の調節が、ヒスチジンによるグリア瘢痕領域の縮小に寄与した可能性は低い。

アストロサイト遊走に対するヒスチジンの作用がグリア瘢痕領域の減少に起因するかどうかを調べるために、反応性アストロサイトに囲まれた梗塞領域を測定することによってアストロサイトの分布を定量化した。虚血後 7 日目には、対照群と His 1000 群の間に梗塞領域のサイズに差はありませんでしたが、虚血後 14 日目には、対照と比較して His 1000 ～ 500 群の梗塞領域が顕著に減少しました (33.7 ± 2.1% vs. 49.0 ± 2.3%、P < 0.001; 図 3A、B; n = 6-8)、これは、ヒスチジンが脳虚血後の治療の後期段階で星状膠細胞が梗塞中心に向かって移動するのを促進することを示唆しています。 14 日目の梗塞領域が対照と比較して His 1000-0 グループで変化しなかったという事実は、後期段階でのヒスチジンによる治療が梗塞中心への星状細胞の移動に不可欠であったことを示唆しています (43.7 ± 2.7% vs. 49.0 ± 2.3 %; 図 3A、B; n = 6–8）、これにより、後で瘢痕バリアの瘢痕形成がより薄くなる可能性があります（図 2B、D、F）。

ヒスチジンは、梗塞中心への反応性アストロサイトの移動を促進します。

GFAP免疫染色をtMCAOの7日後および14日後に実施し(A)、反応性星状細胞に囲まれた梗塞領域を定量した(B)。 Aの矢印で示されたグリア瘢痕端からのアストロサイトの形態をC1〜3に示し、拡大画像をC4〜6に示しました（GFAP：緑色、DAPI：青色）。 C4〜6の矢印は分極した星状細胞を示します。長さ (D)、幅 (E)、突起の長さと幅の比 (F)、および分極星状細胞の割合 (G) を、tMCAO 後 14 日目のグリア瘢痕エッジで定量しました。 n = 6 ～ 8。 A: バー = 1 mm。 C1–3: バー = 100 μm。 C4–6: バー = 50 μm。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、tMCAO グループとの比較、#P < 0.05、##P < 0.01、###P < 0.001、His 1000–0 グループとの比較。

細胞の移行は、高度に調整された複数のステップからなるプロセスです。移動するために、細胞はまず細胞外シグナルに応答して、細長い突出を特徴とする特徴的な分極形態を獲得します19。グリア瘢痕端の星状細胞の形態を分析したところ（図3C-G; n = 6-8）、His 1000-500処理では相対長が有意に増加したが、His 1000-0処理では（1.36 ± 0.10 vs .1.00 ± 0.03; P < 0.01）、星状膠細胞の突出の相対的な幅は減少しましたが（0.66 ± 0.05 vs. 1.00 ± 0.05; P < 0.01）、そのため長さと幅の比が上昇しました（2.22 ± 0.34 vs. 1.00 ± 0.04）。 ; P < 0.01)。さらに、突起の長さが幅を少なくとも4倍超えるという基準を持つ分極細胞の割合は、His 1000〜500治療群で増加しました（40.1±2.7対21.9±2.4; P < 0.001）。

アストロサイト遊走に対するヒスタミンの効果を確認するために、遊走距離を創傷治癒アッセイによって評価しました（図4A、B; 3〜4の独立した実験から）。ヒスタミンは創傷境界における星状細胞の移動を大幅に促進し、10-7 mol/Lの用量で最大の効果を示しました（1.86 ± 0.10 vs. 1.00 ± 0.06; P < 0.001）。細胞遊走反応の別の一般的な検査であるトランスウェル遊走アッセイでも、ヒスタミン投与後により多くの遊走細胞があることがわかりました（図4D、F; 3〜4の独立した実験より）。 10-7 mol/L ヒスタミンは星状細胞遊走の最大の促進を示しましたが (1.67 ± 0.03 vs. 1.00 ± 0.10; P < 0.001)、そのような効果は用量の増加とともに減少しました。

ヒスタミンは、インビトロの創傷治癒アッセイおよびトランスウェル遊走アッセイにおいて星状細胞遊走を促進します。

位相差顕微鏡写真は、ヒスタミン (HA) 10-7 mol/L 処理下での、引っ掻き後 0 時間、24 時間、および 48 時間での星状細胞の遊走を示します (A、白い線は傷の端を示します)。移動距離は、スクラッチの 24 時間後に、さまざまな濃度のヒスタミンの下で定量化されました (B)。星状細胞遊走に対するヒスタミンの効果も、ヒスタミン 10-7 mol/L 処理下で遊走した星状細胞の代表的な画像 (D) を用いて、トランスウェル遊走アッセイ (F) で分析しました。創傷境界に葉状仮足を有する細胞を、10-7 mol/L ヒスタミン処理下で引っ掻きの 2 時間または 4 時間後に計数しました (G)。代表的な画像はローダミン - ファロイジンで染色して F-アクチンを示しました (C、矢印は細胞を示します)葉状仮足を伴う）。スクラッチから 24 時間後、ヒスタミン 10-7 mol/L で処理した細胞は、GFAP で緑色に、DAPI で青色に染色されました。創傷境界におけるアストロサイトの形態を分析しました。これには、長さ (H)、幅 (I)、突起の長さと幅の比 (J)、分極アストロサイトの割合 (K) が含まれます。代表的な画像を図に示します。 (E)。プレーティングの30分後にポリ-L-リジンおよびラミニンに接着する星状細胞の割合をL単位で定量した。値は3〜4回の独立した実験によるものである。 C: バー = 50 μm。 D、E: バー = 100 μm。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、対照 (CON) グループと比較。

細胞前部では、アクチンの集合によって葉状仮足と呼ばれる平膜突起の伸長が促進され、これが遊走のための細胞の極性化に寄与します 23。繊維状アクチン (F-アクチン) の染色で示されるように、ヒスタミンは創傷境界に葉状仮足を持つ細胞の割合を増加させました (図 4C、G)。次に、GFAP免疫染色によって創傷境界におけるアストロサイトの形態を調べました。図4E、H〜K（3〜4の独立した実験から）に示すように、生体内と同様に、ヒスタミンは突起の相対的な長さを著しく増加させました（1.38±0.02対1.00±0.02; P < 0.001）。突起の長さ対幅 (1.85 ± 0.06 vs. 1.00 ± 0.04; P < 0.001)、分極細胞の割合 (77.5 ± 3.3 vs. 31.9 ± 2.5; P < 0.001)、しかし突起の相対的な幅は減少しました (0.75 ± 0.02)対 1.00 ± 0.04; P < 0.001)。分極に続いて、細胞は細胞外マトリックスをアクチン細胞骨格に接続して突起を固定し、細胞体を牽引する接着を形成するため、接着の変化も遊走に影響を与える可能性があります24。しかし、我々の研究では、ポリ-L-リジンまたはラミニンでコーティングされた表面でテストされたアストロサイトの接着能力はヒスタミン処理後も変化しないことが示されました（図4L）。まとめると、これらの結果は、ヒスタミンがおそらく星状細胞の分極化を促進することによって、梗塞中心への星状細胞の移動を促進することを示唆しています。

ヒスタミン H1 受容体と H2 受容体は両方ともアストロサイトで発見されています 25,26 が、その正確な機能はほとんどわかっていません。我々は、創傷治癒アッセイにおいて、H2アゴニストのアムタミンがアストロサイトの遊走に対してヒスタミンと同様の作用を示すのに対し、H2アンタゴニストのシメチジンとファモチジンは両方ともアストロサイトの遊走に対するヒスタミンの促進効果を無効にすることを発見した（図5A;3〜4の独立した実験より）。一方、H1アンタゴニストのピリラミンは、前述のヒスタミンの作用を阻害できません（補足図5）。 PKA はヒスタミン H2 受容体活性化の下流シグナル経路にあります 27。我々は、PKA阻害剤Rp-cAMPもヒスタミンによって促進される星状細胞遊走を逆転させることを発見し（図5A；3〜4の独立した実験より）、これにより星状細胞遊走に対するヒスタミンの作用におけるH2受容体の関与がさらに確認された。さらに、シメチジン、ファモチジン、ピリラミンおよびRp-cAMPの単独投与は星状細胞の遊走に影響を与えなかった。

ヒスチジンは星状細胞の遊走を促進し、H2 受容体を介して神経保護を提供します。

創傷治癒アッセイでは、10-7 mol/L のシメチジン (Cime)、10-7 mol/L のファモチジン (Famo)、または 10-5 mol/L の Rp-cAMP がスクラッチ後に投与されました。 7 mol/L ヒスタミン (HA) または 10-8 mol/L アンタミン (Amth) を 30 分後に添加しました。星状細胞遊走に対するそれらの効果を(A)に示した。シメチジン治療も 2 つの段階（最初の週と後の週）に分割され、その間はシメチジンは投与されないか、または各ヒスチジン注射の 30 分前に 20 または 100 mg/kg の用量で投与されました（Cime 20 ～ 20、Cime を含む）。 100–100、Cime 0–100、および Cime 100–0 レジメン。 tMCAO から 14 日後のグリア瘢痕端からの星状細胞の形態を B に示します (GFAP: 緑色、DAPI: 青色)。長さ (C)、幅 (D)、突起の長さと幅の比 (E)、および分極星状細胞のパーセンテージ (F) を定量化しました。反応性星状細胞に囲まれた梗塞領域を (G) で定量化しました。神経学的欠損スコアは、tMCAO の 1 日、3 日、7 日、および 14 日後に評価され (H)、梗塞領域も TB 染色で推定されました (I)。 A: 値は 3 ～ 4 回の独立した実験によるものです。 B–I: n = 10–12。バー = 50 μm。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、各試験日または各試験内での対照グループ (A) または tMCAO グループ (C-I) との比較。各試験日または各試験内でヒスタミンまたは His 1000 ～ 500 グループと比較した #P < 0.05、##P < 0.01、###P < 0.001。

in vivo でのヒスチジンの作用における H2 受容体の関与を検証するために、各ヒスチジン処理の前にシメチジンを注射しました (図 5B-I)。グリア瘢痕端における星状細胞の分極も、0〜14日または7〜14日のシメチジン（100 mg/kg）注射によって鈍化されることがわかりました（それぞれCime 100〜100またはCime 0〜100の組み合わせと呼ばれます）。これは、His 1000〜500単独での治療と比較して、突起の長さが短くなり、分極した細胞の割合が減少したが、突起の幅が増加したことで明らかでした（図5B〜F; n = 10〜12）。 His 1000-500 治療後の反応性星状細胞に囲まれた梗塞領域の減少は、虚血後 0-14 日または 7-14 日のシメチジン (100 mg/kg) 注射によっても無効になりました (図 5G; n = 10-12) ）。しかし、0～7日間のシメチジン治療（100 mg/kg、Cime 100-0併用治療と呼ぶ）にはそのような効果はなく、特に後期におけるH2受容体の遮断がヒスチジンによるアストロサイト遊走促進を逆転させたことを示唆している。。

神経学的欠損スコアと梗塞領域もシメチジン注射後に評価されました（図5H、I; n = 10〜12）。再度、シメチジン（100 mg/kg）注射を0～14日または7～14日間行ったところ、脳虚血後14日目に評価されたヒスチジン誘発神経欠損スコアの減少は逆転しなかったが、0～7日では逆転しなかった。も発生しました（図5H; n = 10〜12）。並行して、ヒスチジンによってもたらされる梗塞領域の縮小は、0〜14日または7〜14日の間に注射されたシメチジン（100 mg/kg）によって無効になりました（図5I; n = 10〜12）。一方、H1受容体アンタゴニストのピリラミンは、アストロサイトの分極に対するヒスチジンの作用に影響を与えません（補足図5）。これらのデータは、星状細胞遊走に対するヒスタミンの促進効果が H2 受容体によって媒介されており、これがその神経保護効果に寄与している可能性があることを示しています。

多くの研究により、RhoA、Rac1、CDC42 などの Rho GTPase が、細胞遊走に先立つ分極の確立の基礎となるシグナル伝達経路に重要であることが明らかになり、その中でも Rac1 が葉状仮足の形成における主要な活性化因子であると考えられています 23。 GTP結合Rac1をテストするGTPaseプルダウンアッセイで調べたところ、ヒスタミンは活性型Rac1のレベルを増加させる一方、シメチジンとRp-cAMPは両方ともヒスタミンによるRac1の上方制御を無効にすることを発見した（図6A;3〜4から）独立した実験）。さらに、Rac1阻害剤NSC23766は、ヒスタミンによるアストロサイト遊走の促進を逆転させた（図6B；3〜4の独立した実験より）。これは、ヒスタミンがH2受容体を介したアストロサイト遊走とその後の活性型Rac1の上方制御を促進する可能性があることを示唆している。

small GTPase Rac1 の阻害は、アストロサイトの遊走とヒスチジンによる神経学的回復を妨げます。

創傷治癒アッセイでは、シメチジン (Cime、10-7 mol/L) または Rp-cAMP (10-5 mol/L)、Rac1 阻害剤 NSC 23766 を指定濃度で引っ掻き傷の後に投与しました。ヒスタミン(HA)を30分後に添加した。 GTP に結合した small GTPase Rac1 を、スクラッチの 24 時間後にウェスタンブロッティング分析によって調べました (A)。スクラッチ後24時間の移動距離の定量化をBに示した。tMCAO後、tMCAOの7日後から14日までの各ヒスチジン注射の30分前に、50μgのNSC23766を脳室に送達した。反応性星状細胞に囲まれた梗塞領域と、tMCAO 14 日後のグリア瘢痕端の星状細胞の形態に対する効果を、GFAP 免疫染色 (GFAP: 緑色、DAPI: 青色) で (C、D) に示しました。長さ (E)、幅 (F)、突起の長さと幅の比 (G)、および分極星状細胞のパーセンテージ (H) を定量化しました。神経学的欠陥スコア (I) は tMCAO 後 1 日、3 日、7 日、14 日、および 28 日に評価され、認知能力は文脈および手掛かり恐怖条件付けテスト (27 日目、J) およびモリス水迷路によって評価されました。 (22 ～ 24 日目、K) と代表的な水泳経路 (24 日目、灰色の円はプラットフォームの位置を示します)。 TB 染色によるグリア瘢痕領域 (L) および梗塞領域 (M) を、tMCAO の 28 日後に測定しました。 A および B: 値は 3 ～ 4 回の独立した実験です。 C – L: n = 10 – 12。 D: バー = 50 μm; L: バー = 100 μm。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、各試験日または各試験内で対照グループ (A、B) または偽グループ (J、K) と比較。 #P < 0.05、##P < 0.01、###P < 0.001、ヒスタミン治療グループ A および B) または tMCAO グループ (C-M) と比較。 &P < 0.05、&&P < 0.01、&&&P < 0.001、各テスト日または各テスト内での彼の 1000 ～ 500 グループとの比較。

ヒスチジンの保護効果におけるアストロサイト遊走の関与をさらに検証するために、tMCAO後7〜14日間Rac1阻害剤NSC23766を脳室に送達し、その間にアストロサイトは梗塞中心に向かって遊走した（図3A、B）。反応性星状細胞に囲まれた梗塞領域は、ヒスチジン治療と併用したNSC23766の送達後に拡大しました（図6C; n = 10〜12）。星状細胞の分極も、突起の長さ、幅に対する長さの比、および分極細胞の割合の増加によって示されるように、NSC23766によって無効になりましたが、突起の幅は減少しました（図6D–H;図6D-H; n = 10–12)、これは、NSC23766 がヒスチジンで上方制御される星状細胞遊走を阻害できることを示唆しています。 NSC23766 はまた、脳虚血後のヒスチジン誘発性神経機能改善を逆転させました (図 6I; n = 10-12)。恐怖条件付けテストとモリス水迷路テストでは、NSC23766はヒスチジンによってもたらされた認知能力の改善を強力に逆転させました（図6J、K; n = 10〜12）。さらに、NSC23766 は、グリア瘢痕領域 (図 6L; n = 10-12; 0.58 ± 0.03 vs. 0.39 ± 0.03; P < 0.001) および TB 染色で示される梗塞領域のヒスチジン誘発性縮小を無効にしました (図 6M)。 ; n = 10-12; 38.9 ± 4.2 vs. 27.5 ± 2.4; P < 0.05)。これらの発見を総合すると、アストロサイトの遊走が脳虚血後のヒスチジンの神経保護効果にとって重要であることが示唆される。

ヒスタミンは脳虚血後の初期段階で神経保護を提供することが報告されており、これはニューロン、星状細胞、または炎症細胞に対するヒスタミンの作用によるものと考えられています28。ヒスチジンとその前駆体であるカルノシンも、その抗酸化作用と抗アポトーシス作用により、脳虚血発症後の非常に早い段階で直接的な神経保護作用があります29,30。しかし、脳虚血後の後期におけるヒスタミンまたはその関連物質の作用は研究されていません。今回、行動的および病理学的評価を通じて、ヒスタミンの前駆体であるヒスチジンが用量と段階に応じて長期的な神経保護を提供することを発見しました。この保護は主に、星状細胞遊走の促進によるグリア瘢痕形成の制限によるものと考えられます。私たちの研究は、脳虚血誘発性脳損傷の治療戦略としてのアストロサイト機能の調節に焦点を当てています。

ヒスチジン治療の用量と段階に依存したレジメンは、行動検査、病理学的検査、および in vitro 実験の結果に基づいて次のように提案されました (図 1、2、および 4)。 1) 1) 一貫した用量 1000 mg/kg のヒスチジンは、神経機能の改善は、用量と段階に応じた治療法ほど顕著ではありません。 2) ヒスチジン (1000 mg/kg) は初期段階のみ (His 1000-0 グループを指す) では、後期段階の神経障害および恐怖記憶に対する保護効果はありません。 3) 初期段階では 1000 mg/kg の高用量で、後期では 200 または 500 mg/kg の低用量でのヒスチジンは、神経機能と梗塞領域に関して優れた保護をもたらしました。後期段階では最も顕著な保護効果があるが、初期段階では低用量、後期段階では高用量という逆の用量順序のレジメンには保護効果がない（データは示されていない）。 4) His 1000-500 による治療のみがグリア瘢痕領域を縮小しました。 5) in vitro での星状細胞遊走の促進は、ヒスタミンの用量が増加するにつれて減少します。これは、高用量のヒスタミンが後期段階で起こる星状細胞遊走に利益をもたらさない可能性を示唆しています。したがって、我々の研究は、用量と段階に依存した治療戦略が脳虚血の治療に効果的であることを示唆した。

この用量と段階に依存するレジメンによる保護効果に寄与する根本的な要因は複雑であり、これはおそらく脳虚血誘発性脳損傷に対して複数の作用が関与しているためであると考えられます。虚血発症後の初期段階で投与される1000 mg/kgの用量のヒスチジンは、梗塞体積と神経細胞死を減少させ、神経細胞の生存、星状細胞のグルタミン酸クリアランスおよび炎症性細胞浸潤の阻害に対するヒスチジンの作用が、根底にあるメカニズムであることが示唆されている11,28。これらの急性または亜急性事象は通常、虚血後数日または 1 週間以内に起こり、この段階でのアストロサイトの救出が有益な役割を果たすことがよくありますが、アストロサイトは徐々に強固な障壁を形成し、その後のニューロンの再構築を妨げます。時間経過に基づく厳密な治療計画はまだ研究されていないが、現在の高用量と低用量の併用療法では、ヒスチジンは形成グリア瘢痕バリアを著しく低下させ、これが行動欠陥や梗塞に対するヒスチジンの顕著な長期保護の基礎となっている可能性がある。したがって、ヒスタミン作動系は、用量と段階に応じて脳虚血後のアストロサイトの作用を調整することにより、有望な治療標的となる可能性があります。

さらに、私たちの研究は、ヒスチジンまたはヒスタミンが増殖と活性化には影響せず（補足図2〜4）、アストロサイトの移動にのみ影響し（図3）、その結果、グリア瘢痕バリアが薄くなることが示されました（図2B、D）、F、6L）。さらに、NSC23766による星状細胞遊走の遮断によりヒスチジン誘導性の神経保護が消失したという事実から明らかなように、星状細胞遊走の促進が保護に寄与していることも判明した（図6）。他の研究では、アストロサイトの遊走が神経保護に寄与していることも示唆されています。脊髄損傷では、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3 阻害による遊走星状細胞の刺激後に有益な効果が観察されました 31。さらに、アドレノメデュリンは、星状細胞の遊走を促進しながら、脳虚血誘発損傷に対する神経保護を提供します 32。注意すべきこととして、この遊走は、アストロサイトが梗塞中心に向かって移動または移動することと呼ばれることが多く、アストロサイトが半影領域に蓄積するグリア瘢痕を形成するためのアストロサイトの遊走とは異なる場合がある。

星状細胞遊走による利点に対する直接的な懸念の 1 つは、それがグリア瘢痕を圧縮してより薄い障壁を形成し (図 2B、D、F および 6L)、グリア瘢痕のないより大きな半影領域を生成することである可能性があります (図 3A、B および 6C)。）、周縁部の神経新生を抑制するように。ヒスチジン処理後のグリア瘢痕端ではより多くの新生ニューロンが見つかり、星状細胞遊走の遮断とともにRac1阻害剤NSC 23766によって無効化されたため、この考えはもっともらしいです（補足図6）。また、遊走した星状細胞は炎症細胞を梗塞中心に収縮させる可能性があり、これは脊髄損傷で確認されています 31。さらに、アストロサイトの活性化と増殖の阻害など、グリア瘢痕形成を抑制する他の方法はアストロサイトの正常な機能に影響を与える可能性があるため、アストロサイトの遊走を操作することによるグリア瘢痕形成の制御が神経保護を生み出す優れたアプローチである可能性があることは注目に値します。虚血の初期段階で病変領域の拡大を引き起こします。実際、アストロサイトGFAPとビメンチンダブルノックアウトマウスを使用してアストロサイトの活性化を除去すると、梗塞体積が拡大しました。これは、アストロサイトにおけるグルタミン酸輸送、ギャップ結合、およびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤-1発現の変化に関連している可能性があります33。

H2受容体のアンタゴニストとアゴニストの適用とインビトロでのシグナル伝達経路の遮断による我々の研究で示されているように、星状細胞の遊走はH2受容体によって媒介されます（図5）。さらに、H1 アンタゴニストではなく H2 アンタゴニストも星状膠細胞の遊走を阻害し、ヒスチジンによる梗塞領域の減少を逆転させました。注目すべきことに、H2アンタゴニストによる治療の全過程において、上記と同様の効果は、アストロサイト遊走が進行する脳虚血後の後期段階でのみ観察された。したがって、アストロサイトのH2受容体の活性化は、アストロサイトの梗塞領域への移動を促進し、少なくとも脳虚血後の後期段階で神経保護をもたらしますが、H1受容体はおそらく関与していません（補足図5）。

脳虚血後のヒスタミンの多様な作用は、H1 受容体や H2 受容体などの複数の受容体の関与に大きく依存している可能性があり、さまざまな作用を介してさまざまな細胞に影響を与えます 12、28、34、35。私たちの研究は、長期的な神経保護を提供するために、H2 受容体を介したアストロサイトの遊走に対するヒスタミンの新たな効果を明らかにしました。さらに、ヒスタミンは学習と記憶を改善することがわかっているため、脳虚血後の認知障害に対するヒスチジンの直接的な影響を除外することはできません 36,37,38。海馬へのヒスタミンの送達は、H1 受容体と H2 受容体の両方を介して放射状アーム迷路課題における空間記憶障害を改善します 36。 H2 受容体アゴニストであるアムタミンまたは RAMH をトレーニング後に背側海馬に両側注射すると、状況に応じた恐怖条件付け後の記憶の定着が促進されます 37。したがって、ヒスタミンまたはその関連薬剤は、長期の脳虚血損傷時の機能回復の潜在的な候補となる可能性があります。

Rho GTPase は細胞遊走において中心的な役割を果たしており、その中には Rac1 誘導性葉状仮足形成があります 38。ヒスタミンで処理した培養星状細胞、またはヒスチジンで処理したラットの組織のグリア瘢痕端では、高い比率の分極星状細胞および葉状仮足形成が観察されました。さらに、活性型 GTP 結合低分子 GTPase Rac1 はヒスタミンによって上方制御されましたが、これはシメチジンまたは Rp-cAMP によって元に戻すことができます。 Rac1 特異的阻害剤である NSC 23766 は、ヒスタミンによる星状細胞遊走の促進を無効にしました。したがって、ヒスタミンは、H2 受容体とそれに続く Rac1 の活性化を介して梗塞領域への星状細胞の遊走を促進し、これにより、CNS における星状細胞の遊走におけるヒスタミンの役割についての知識が深まります。

結論として、我々のデータは、ヒスチジンによる用量と段階に応じた治療が、H2受容体を介して梗塞領域へのアストロサイトの移動を促進し、その後の活性型Rac1の上方制御を促進し、これが脳虚血後の長期の神経機能回復に利益をもたらすことを示している。また、ヒスタミン作動性系を標的とすることは、アストロサイトに対するその作用により、長期脳虚血誘発性傷害に対する新たな治療戦略となる可能性があることも示唆されている。

体重 250 ～ 280 の雄の Sprague-Dawley (SD) ラットを in vivo 実験に使用し、SD 新生児ラットを星状細胞培養実験に使用しました。すべての実験は浙江大学動物実験委員会の倫理ガイドラインによって承認され、それに従って実施され、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに完全に準拠しました。痛みや不快感を最小限に抑える努力が払われ、使用される動物の数も最小限に抑えられました。以下のすべての実験において、動物は無作為に対照群と治療群に分けられました。

コラール水和物(350 mg/kg)の腹腔内注射によりラットを麻酔した。前述のように、一過性局所脳虚血は tMCAO によって誘発されました 39。簡単に説明すると、先端が鈍く、1% ポリ-L-リジンでコーティングされた 6-0 ナイロンモノフィラメント縫合糸を内頚動脈に 18 mm 進めて、中大脳動脈 (MCA) の起始部を閉塞しました。中大脳動脈の領域における脳血流（CBF）は、レーザードップラー流量計40（Periflux System 5010; Perimed、Jarfalla、スウェーデン）によって測定されました。柔軟な光ファイバープローブを、右ＭＣＡの近位部分によって供給される皮質上の頭蓋骨に取り付けた（ブレグマまで尾側２ｍｍ、正中線まで側方６ｍｍ）。 MCA領域の中心部でCBFが80%未満減少した動物は研究から除外された。 90 分間の閉塞後、モノフィラメントを除去することによって再灌流を実行しました。再灌流後のCBFが閉塞前のCBFの60%に達していないラットは除外した。手術中および再灌流開始後の 2 時間、体温を加熱ランプ (FHC、Bowdoinham) によって 37 °C に維持しました。

4 つの別々の実験がありました。それぞれの中で、ラットは以下のように無作為に治療グループに割り当てられました（補足図7）。実験 1、最初の 1 週間、ラットに 200、500、または 1000 mg/kg のヒスチジンを与えました。実験 2、ラットには最初の週に 1000 mg/kg ヒスチジンが与えられましたが、その後の週には 0、200、500、または 1000 mg/kg ヒスチジンが与えられました。これらは His 1000–0、His 1000–200、His 1000–500 または彼の 1000 ～ 1000 のグループ。ヒスチジン治療では、ヒスチジン (Sigma、米国) を生理食塩水に溶解し、tMCAO 後 0 時間、6 時間、および 1 日おきに腹腔内注射しました。対照として、ラットには同量の生理食塩水を注射した。実験 3 では、His 1000 ～ 500 治療に加えて、シメチジン治療も 2 段階 (最初の週と後の週) に分けられ、その間、各ヒスチジン注射の 30 分前にシメチジン (20 または 100 mg/kg) が腹腔内投与されました。 Cime 20–20、Cime 100–100、Cime 0–100、Cime 100–0 レジメン。実験4では、His 1000-500治療とともに、tMCAO後2週間のヒスチジンの各注射の30分前に、Rac1阻害剤NSC 23766（50μg）を対側心室に送達した。 tMCAO39 の 1、3、7、14、28、42、56 日後に神経機能をスコア化し、モリス水迷路 (22 ～ 25 日目、50 ～ 53 日目) および文脈的恐怖条件付け (26 ～ 27 日目、 54～55日目）を屠殺前に評価した41、42、43。免疫組織化学、ウェスタンブロットまたはTB染色のために、tMCAOの7、14、28または56日後にラットを屠殺した。各グループの包含動物数と除外動物数を補足表 1に示しました。

初代皮質星状細胞培養物は、以前に記載されているように、生後 1 ～ 2 日の SD ラットから調製されました 44。滅菌した20μlピペットチップを使用して細胞層に傷を付けた。次いで、プレートを滅菌ＰＢＳですすぎ、細胞破片を除去し、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した新鮮な細胞培養培地と交換した。示された濃度のシメチジン、Rp-cAMP、または NSC23766 を培地置換液に添加し、30 分後にヒスタミンを添加しました。スクラッチから0、24および48時間後に、細胞をGFAPで染色するか、位相差顕微鏡(オリンパス、日本)で観察した。引っかき傷の２つの端の間の距離は、ＮＩＨＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、傷の面積を引っかき傷の長さで割った値を測定することによって決定された。低分子量 GTPase 分析の場合、スクラッチの 2 時間後に細胞タンパク質サンプルを調製しました。

免疫組織化学のために、ラットをコーラル水和物（３５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、氷冷生理食塩水および４％パラホルムアルデヒドで経心臓的に灌流した。脳を取り出し、4%パラホルムアルデヒド中で4℃で24時間後固定し、その後PBS中の30%スクロース中で3日間後固定した。冷凍脳切片をクライオスタット(ライカ、ドイツ)上で10μmに切断した。免疫細胞化学のために、星状細胞単層を 4% パラホルムアルデヒドで 10 分間固定しました。次いで、培養星状細胞または脳切片を、0.1%または0.3% Triton X-100を含むPBS中の3%正常ロバ血清とともにそれぞれ15分間インキュベートした。次に、GFAP に対する一次抗体 (1:400、Boster、中国) を適用し、4 °C で一晩インキュベートしました。 PBS中で繰り返し洗浄した後、Alexa 488結合抗ウサギIgG(1:400; Invitrogen, USA)を適用し、室温で2時間インキュベートした。 F-アクチン染色では、抗体インキュベーションの代わりに、細胞をローダミン-ファロイジン（1:500、Invitrogen、米国）中で30分間インキュベートしました。繰り返し洗浄した後、切片または培養星状細胞を、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI、1:1000; Sigma、米国) を含む封入剤に封入しました。最後に、蛍光顕微鏡 (オリンパス BX51、日本) で画像を撮影しました。グリア瘢痕の定量化のために、ジアミノベンジジン組織化学染色を実施した。内因性ペルオキシダーゼはメタノール中の 3% H2O2 で処理することによりクエンチされ、スライドは 10% 正常ヤギ血清でブロックされました。次いで、スライドをGFAPに対する抗体(1:200、Boster、中国)で染色し、Histostain-Plus IHC Kit(MR Biotech、中国)によって処理した。次いで、ＰＢＳで１０分間３回洗浄した後、切片をマウントした。グリア瘢痕面積の測定、細胞計数および形態解析は、Image-Pro Plus (Media Cybernetics、Silver Spring、USA) および Image J ソフトウェア (NIH、Bethesda、MD) によって実行されました。突起の長さは、核の背面から突起の先端までの距離として決定されました。幅は突起の底部で測定した。突起の長さが突起の幅を少なくとも 4 倍超えた場合に、分極した細胞をスコアリングしました 45。各動物について、3 つのスライスのグリア瘢痕領域から合計約 500 個の星状細胞を検査しました。

梗塞領域を定量化するために、一連の冠状脳切片をクライオスタット（ライカ、ドイツ）上で３０μｍで切断し、脳全体にわたって１．５ｍｍごとに収集した。切片を 1% TB で染色して、非梗塞組織を特定しました。梗塞領域のパーセンテージは、対側半球の合計領域に対する梗塞領域の比率の100倍として計算されました。反応性アストロサイトに囲まれた梗塞領域も、同じ手段によりGFAP免疫染色後に推定した。

培養星状細胞をタンパク質抽出試薬中でホモジナイズしました。活性型 GTP 結合 Rac1 は、GTPase Pull-Down キット (Thermo, USA) で単離されました。次に、タンパク質サンプルを 12.5% SDS-ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロース膜に電気転写しました。 5% 無脂肪乳でブロッキングした後、メンブレンを rac 1 (1:500; Millipore、米国) および GAPDH (1:3,000、KangChen、中国) に対する一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。繰り返し洗浄した後、メンブレンを IRDye 800 抗ウサギ分子プローブ (1:8000、LI-COR Biosciences、米国) または IRDye 700 抗マウス分子プローブ (1:3000、LI-COR Biosciences、米国) と 2 分間反応させました。 h. 画像は、Odyssey 赤外線イメージングシステム (LI-COR Biosciences、米国) で取得し、分析しました。

以前の報告に従って、遊走アッセイは BD matrigelTM 浸潤チャンバー (24 ウェル) を使用して実行されました 46。簡単に説明すると、星状細胞懸濁液 (2 × 106/ml、1% FBS を含む 0.2 ml) をトランスウェルインサートに添加し、一方、示された濃度のヒスタミンを 5% FBS を含む底部ウェルにロードしました。 24 時間のインキュベーション後、インサートをトランスウェルから取り外し、綿棒でトランスウェルの内部を軽く拭いて非遊走細胞を除去しました。次に、遊走した細胞を 4% パラホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色しました。定量的分析のために、各インサートで遊走した細胞の数を数えました。

3 × 105/ml の星状細胞を、あらかじめポリ-L-リジンまたはラミニンでコーティングした 96 ウェル培養プレート上で 10-7 mol/L ヒスタミン中で 30 分間継代培養しました 38。 PBSで繰り返し洗浄した後、細胞をMTT（Sigma、米国、最終濃度として0.5 mg/mL）とともに37℃で4時間インキュベートした。次に、上清層を除去し、各ウェルに100μLのジメチルスルホキシドを加えた。 MTT代謝は、Biotekマイクロプレートリーダー(米国)により570nmで分光測光的に定量した。

すべてのデータはブラインド方式で収集および分析されました。データは平均±SEMとして表示されます。各試験日内の神経学的欠損スコアは、ノンパラメトリックなクラスカル・ウォリスH検定によって分析されます。各試験日内または各試験からの他の行動データ、および病理学的検査およびインビトロ細胞培養実験における他の多重比較は、一元配置分散分析とそれに続くテューキー検定によって分析されましたが、両側スチューデントの t 検定は、間の他の比較に適用されました。 2つのグループ。さらに、一般的な線形モデルを使用して、すべてのテスト日を考慮して、モリス水迷路テストにおける異なる治療グループ間の潜伏時間の違いを分析しました。すべての分析について、検定は両側で行われ、P < 0.05 が有意であるとみなされました。サンプルサイズの計算は次の式に基づいて行われます。 μα = 1.62(α = 0.05); μβ = 1.28(β = 0.10); σ = 平均 SD; δ = グループ間の平均差。

この記事の引用方法: Liao, R.-J. 他。ヒスチジンは、星状膠細胞の遊走を促進することにより、脳虚血後の長期的な神経保護を提供します。科学。議員 5、15356; 土井: 10.1038/srep15356 (2015)。

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この研究は、中国国家自然科学財団 (81030061、81273490、81273506、81473186)、中国国家基礎研究 973 プログラム (2011CB504403)、浙江省自然科学財団 (LY12H31006)、および浙江省リーディングチームプログラムから資金提供を受けました。科学技術イノベーション (2011R50014) の。言語編集については、Muteflame Inc. (カナダ、ウィンザー) に非常に感謝しています。

Liao Ru-jia、Jiang Lei、Wang Rongrong も同様にこの研究に貢献しました。

中国保健省医療神経生物学主要研究所薬理学部門、浙江大学医学部基礎医学部、杭州、310058、中国

ルージア・リャオ、レイ・ジャン、ロンロン・ワン、イン・チェン、ヤー・リー、ルー・ワン、ユウドン・チョウ、シャンナン・チャン、チョン・チェン、ウェイウェイ・フー

310003 中国、杭州、浙江大学医学部、第一附属病院、感染症の診断と治療のための共同イノベーションセンター薬理学部門

ワン・ロンロン、チャン・シャンナン、チョン・チェン、フー・ウェイウェイ

浙江大学小児病院薬理学部、杭州、310006、中国

趙華偉

浙江大学医学部第二付属病院放射線科、杭州、310009、中国

リー・ヨン・ジエ

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WWH と ZC は仮説を提案し、実験を計画し、原稿を書きました。 RJL、LJ、RRW、HWZ、LYJ が実験を実施しました。 RJL、YC、YL、LW、XNZ がデータを分析しました。 YDZは原稿を大幅に編集した。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Liao、Rj.、Jiang、L.、Wang、Rr. 他。ヒスチジンは、星状膠細胞の遊走を促進することにより、脳虚血後の長期的な神経保護を提供します。 Sci Rep 5、15356 (2015)。 https://doi.org/10.1038/srep15356

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受信日: 2014 年 11 月 30 日

受理日: 2015 年 9 月 9 日

公開日: 2015 年 10 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep15356

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